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雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。
雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收 2 個長波長的光子，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子;其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達(dá)到 80 至 100 兆赫。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時，物鏡的焦點處的光子密度是高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦針孔，提高了熒光檢測效率。為形態(tài)學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、和藥理學(xué)等研究領(lǐng)域中重要的研究手段。
1.雙光子顯微鏡出現(xiàn)的背景----傳統(tǒng)激光共聚焦顯微鏡的兩大局限:
1)一是光毒性現(xiàn)象：因為共聚焦的針孔必須足夠小以獲得高分辨率的圖像，而孔徑小又會擋掉很大部分從樣品發(fā)出的熒光，包括從焦平面發(fā)出的熒光，相應(yīng)的，激發(fā)光必須足夠強以獲得足夠的信噪比;而高強度的激光會使熒光染料在連續(xù)掃描過程中迅速褪色，熒光信號會隨著掃描進程度進行變得越來越弱。
2)光毒作用是另外一個問題，在激光照射下，許多熒光染料分子會產(chǎn)生諸如單態(tài)氧或自由基等細(xì)胞毒素，所以實驗中要限制掃描時間和激發(fā)光的光功率密度以保持樣品的活性。在針對活性樣品的研究中，尤其是活性樣品生長、發(fā)育過程的各個階段，光漂白和光毒現(xiàn)象使這些研究受到很大的限制。
2.為什么說雙光子顯微鏡一般不需要配備紫外激發(fā)激光器?
雙光子顯微鏡技術(shù)是建立在雙光子激發(fā)效應(yīng)的基礎(chǔ)上的一種熒光激發(fā)技術(shù)：熒光染料分子可以同時吸收低能量的兩個光子而被激發(fā)(兩個光子到達(dá)熒光分子的時間間隔小于1飛秒)，其激發(fā)效果可以等同于吸收一個1/2波長的高能量光子。例如，吸收兩個紅色波長的光子，相當(dāng)于一個吸收紫外的分子。長波長的光子不易被細(xì)胞吸收，因此對活細(xì)胞的光毒性減少，也降低了光漂白。這樣即起到紫外激發(fā)的功能，又避免了紫外光線對樣品的傷害。
3.雙光子顯微鏡的激光器有何特別之處?
雙光子吸收幾率依賴于兩個入射光子在空間和時間上的重合程度(兩個光子必須在10-18秒內(nèi)到達(dá))。雙光子吸收截面很小，只有在具有很大光子流量的區(qū)域的熒光團才會被激發(fā)。因此所用激光器多為鈦寶石激光器，可以達(dá)到皮秒或者飛秒級的掃描速度，且具有非常高的峰值功率和較低的平均功率，從而可以減小或者消除光漂白和光毒作用。主要的是在一個很小的范圍提供非常高密度的光子，可以保證雙光子的同時激發(fā)。
4.雙光子激發(fā)的優(yōu)點是什么?
1)增加了染料的選擇性：共聚焦系統(tǒng)的激光器(Ar, Ar/Kr, HeNe)的激發(fā)光范圍在 488nm - 647nm
這就意味著想用紫外激發(fā)熒光染料的實驗進行，例如使用 DAPI , Hoescht
而雙光子的激發(fā)波長是單光子的兩倍，所以紫外激發(fā)的染料能被近紅外光激發(fā)。
2)減少光漂白：因為光漂白減少的減少使得用 CFP/YFP 做熒光共振能量轉(zhuǎn)移( FRET )的實驗的成功率提高。
3)無需特殊的物鏡：從硬件的角度出發(fā)，用近紅外光的波長激發(fā)紫外激發(fā)染料不需要特殊的紫外光學(xué)組件。
4)提高信噪比：激發(fā)光波長和發(fā)射光波長具有很大的差別，提高了信噪比。
5)漂白局限于焦點處：因為熒光激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點上，所以就不需要共聚焦針孔了。這樣提高了光的檢測，而且光漂白只發(fā)生在焦點上。
6)更容易穿透標(biāo)本：紅外波長的光不易被細(xì)胞散射，能穿透更深的標(biāo)本。
5.相對于激光掃描共聚焦顯微鏡，雙光子顯微鏡做的大改進是什么?
1)減少了光漂白。
2)減少了光毒性。
3)不易散射，更易穿透厚樣品，諸如腦片。
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